在完成標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的加樣后，需立即覆蓋封板膜，輕輕震蕩混勻30秒，確保反應(yīng)液充分接觸孔內(nèi)包被的抗體。隨后將酶標(biāo)板置于37℃恒溫孵育箱中，避光孵育60分鐘。此步驟的關(guān)鍵在于溫度與時(shí)間的精準(zhǔn)控制，避免因環(huán)境波動導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

孵育結(jié)束后，小心揭開封板膜，甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入350μL預(yù)冷的洗滌緩沖液（1×PBS），靜置30秒后棄去。重復(fù)洗滌4次，最后一次需在吸水紙上拍干，確保無殘留液體。注意動作輕柔，避免交叉污染或孔壁劃傷。

   接下來，每孔依次加入50μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗工作液，再次覆蓋封板膜，37℃孵育30分鐘。此階段需避光操作，防止酶活性衰減。二抗孵育完成后，重復(fù)上述洗滌步驟5次，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

顯色反應(yīng)是檢測的核心環(huán)節(jié)。每孔加入現(xiàn)配的TMB底物溶液100μL，室溫避光孵育15-20分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品孔呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色梯度變化時(shí)，立即加入50μL終止液（2M硫酸），溶液轉(zhuǎn)為黃色后，于450nm波長下測定各孔OD值。若使用雙波長校正，需同步讀取630nm參比數(shù)據(jù)以減少干擾。

   最后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)，繪制四參數(shù)邏輯曲線（4PL）擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中5-HT含量。若樣本OD值超出線性范圍，建議用稀釋液調(diào)整后復(fù)測。整個(gè)流程需在6小時(shí)內(nèi)完成，以保證試劑穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，妥善處理廢棄酶標(biāo)板及液體，避免生物污染。

注意事項(xiàng)：

1. 所有試劑使用前需平衡至室溫，避免反復(fù)凍融；

2. 加樣時(shí)槍頭避免觸碰孔壁，防止交叉污染；

3. 顯色時(shí)間過長可能導(dǎo)致背景偏高，需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)長。